Dentro de la cromatografía de líquidos distinguimos los métodos de cromatografía en columna y los métodos de cromatografía en superficie plana, en los que la fase móvil se desplaza por la fase estacionaria por acción capilar (a veces ayudada por la gravedad o por la aplicación de un potencial eléctrico). Entre estos últimos están la cromatografía en papel (CP) y la cromatografía en capa fina (TLC).
Las primeras experiencias en cromatografía plana se llevaron a cabo en papel, siendo un método de gran importancia como técnica de separación a principios de los cincuenta, aunque actualmente está totalmente desplazada por la cromatografía en capa fina:
Los soportes empleados están formados por placas delgadas de vidrio, plástico o metal con un fina película de material adherente que constituye la fase estacionaria. Dependiendo del rendimiento de la placa, el recubrimiento de la placa puede tener un espesor de 100 a 250 μm, con un tamaño de partícula que varía entre 5 y 20 μm, aproximadamente.
La muestra se aplica como un punto o banda a 1 o 2 cm del extremo de la placa y se deja secar. Este extremo se pone en contacto con la fase móvil en un recipiente cerrado y saturado con los vapores del disolvente empleado. La separación se produce por la migración diferencial de los componentes de la muestra en la dirección en la que se mueve la fase móvil.
Cuando los solutos son incoloros, una vez realizada la separación cromatográfica se deja secar la placa evaporando el disolvente y se procede al revelado de la misma, mediante un tratamiento químico que origine productos coloreados o fluorescentes.
Tipos de cromatografía en capa fina (TLC)
Dependiendo de la naturaleza del sólido extendido sobre la placa distinguimos:
- TLC de partición: como soporte sólido inerte de la fase estacionaria líquida, que normalmente es de naturaleza polar (agua), se suele utilizar gel de sílice, celulosa o tierra de diatomeas.
- TLC de adsorción: el sólido adsorbente es generalmente sílice o alúmina.
- TLC de cambio iónico: se utiliza una resina intercambiadora de iones sobre la placa.
- TLC de exclusión: se utiliza un material muy poroso pulverizado que origina fenómenos de exclusión según el tamaño molecular de los solutos (generalmente monosacáridos).
La mayoría de los fundamentos aplicados y los parámetros cromatográficos definidos para la cromatografía en columna se pueden aplicar, con ligeras modificaciones, a la cromatografía en capa fina.
Factor de retardo
El factor de retardo (RF) de un determinado analito se define como la relación entre la velocidad de desplazamiento del soluto y la velocidad de desplazamiento de la fase móvil. En un determinado instante, el factor de retardo puede definirse como una relación de distancias:
El factor de retardo varía desde 1 para los solutos que no se retrasan, hasta valores que se aproximan a 0.
Factor de retención en TLC
Son de aplicación todos las definiciones y ecuaciones generales de cromatografía, aunque podemos redefenir algunas de ellas:
Altura de plato en TLC
Al igual que en la cromatografía en columna, la eficacia del proceso cromatográfico viene dada por el número de platos teóricos (N) y la altura de plato teórico (H). Cada analito origina una mancha que se caracteriza por su anchura y su factor de retardo, por lo que podemos definir:
Resolución en TLC
En la mayoría de las ocasiones las manchas que se obtienen para los distintos componentes de una muestra presentan una misma anchura, por lo que la resolución de la separación de dos analitos A y B por cromatografía plana será:
Aplicaciones de la cromatografía en capa fina
La cromatografía en capa fina es muy útil a la hora de elegir la fase móvil apropiada para las separaciones en cromatografía de líquidos de alta eficacia, mediante sencillos y rápidos experimentos de ensayo y error.
La cromatografía HPLC es un método rápido y altamente automatizado, por lo que su uso se ha extendido y ha desplazado a la cromatografía en capa fina. Aunque todavía tiene amplio uso en los laboratorios clínicos y es la estructura de apoyo de muchos estudios bioquímicos y biológicos. Se puede aplicar tanto en la identificación cualitativa de compuestos como en el análisis cuantitativo.
Las diferencias entre cromatografía en columna y cromatografía plana se analizan en el ejercicio 5.
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