Cromatografía por afinidad

La cromatografía por afinidad es un tipo de cromatografía de líquidos que se basa en la unión reversible entre el analito de interés y un ligando específico, inmovilizado en un soporte sólido inerte. Cuando la muestra pasa por la columna, sólo son retenidas las moléculas que se unen de manera selectiva al ligando por afinidad y las que no se unen avanzan con la fase móvil. Después, los analitos retenidos pueden ser arrastrados cambiando las condiciones de la fase móvil.

Las matrices o soportes empleados en cromatografía de afinidad como fase estacionaria deben ser rígidos, resistentes, insolubles, permeables y reactivos. Suelen ser de dos tipos:

• Matrices de polisacáridos (agarosa, celulosa, dextrano)

• Matrices sintéticas (vidrio, poliacrilamida)

Los ligandos por afinidad característicos son anticuerpos, inhibidores de enzimas, o compuestos más generales, como las lectinas (que se enlazan a polisacáridos). Se fijan mediante enlaces covalentes a la fase estacionaria químicamente activada.

La fase móvil desempeña dos funciones distintas:

• Debe soportar el fuerte enlace entre las moléculas del analito y el ligando

• Debe ser capaz de debilitar o eliminar la unión entre el analito y el ligando, una vez se han eliminado las especies indeseables, de modo que el analito pueda ser eluido.

Según la naturaleza de los ligandos y los analitos distinguimos dos procedimientos generales de elución:

• Elución bioespecífica: la fase móvil contiene un inhibidor por el que el analito tiene preferencia (compite con el ligando). El analito se retira entonces del ligando y es eluido.

• Elución no específica: la fase móvil provoca un cambio en el sitio activo del ligando, mediante variaciones del pH, de la constante dieléctrica o de la fuerza iónica del medio. También se puede desnaturalizar el ligando mediante reacciones químicas con urea o tiocianato potásico.

Aplicaciones de la cromatografía de afinidad

La cromatografía por afinidad es muy específica y su mayor campo de aplicación se encuentra en la purificación o aislamiento de sustancias de naturaleza biológica, como proteínas o ácidos nucleicos.

Se utiliza principalmente con fines preparativos en análisis cuantitativos, pues permite aislar con rapidez biomoléculas en estudios bioquímicos.

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