Cromatografía de exclusión por tamaño

La cromatografía de exclusión por tamaño o de gel es un tipo de cromatografía de líquidos en la que la fase estacionaria es un material poroso que permite la elución diferencial de los solutos en función de sus tamaños moleculares.

A diferencia de otros métodos cromatográficos, en la cromatografía de exclusión por tamaño no hay interacción química o física entre los analitos y la fase estacionaria.

Los rellenos empleados en cromatografía de exclusión por tamaño deben ser inertes, estables, resistentes y con un tamaño de partícula y de poro uniformes. Están compuestos por pequeñas partículas de sílice o de polímeros, con un diámetro entre 5 y 10 μm, que tienen una red de poros donde se quedan atrapadas las moléculas de soluto. Los analitos de mayor tamaño no son retenidos por lo que son excluidos y se eluyen con rapidez. Los que tienen tamaños menores que los de los poros pueden penetrar en ellos y son retenidos por más tiempo.

Características de las partículas de sílice:

• Gran rigidez (permite la aplicación de altas presiones)

• Mayor estabilidad (favorece el uso de una gran variedad de disolventes, incluida el agua)

• Regulación rápida al cambiar de disolvente

• Estabilidad a elevadas temperaturas

• Inconveniente: tendencia a retener solutos por adsorción y capacidad para catalizar la descomposición de las moléculas de soluto.

Características de los rellenos poliméricos:

• Copolímeros de estireno y divinilbenceno entrecruzados.

• El tamaño de poro es fácilmente controlable según el grado de entrecruzamiento y, por tanto, de la proporción de divinilbenceno.

• Son hidrófobos.

• En la actualidad se fabrican geles hidrofílicos, compuestos por poliacrilamidas o polímeros sulfonados de divinilbenceno, con los que se pueden emplear disolventes acuosos.

Aplicaciones de la cromatografía de exclusión por tamaño

Distinguimos dos métodos:

• Cromatografía de filtración sobre gel: emplea disolventes acuosos y rellenos hidrofílicos.

• Cromatografía de penetrabilidad sobre gel: emplea disolventes orgánicos no polares y rellenos hidrofóbicos.

La cromatografía de exclusión por tamaño es de gran utilidad en la separación de compuestos de elevado peso molecular (proteínas, polímeros, ácidos grasos, glúcidos).

La masa molecular máxima por encima de la cual el analito ya no es retenido por un determinado relleno se conoce como límite de exclusión:

Las ventajas de los procedimientos de exclusión por tamaño son:

• Tiempos de separación cortos y muy bien definidos

• Bandas estrechas que permiten una buena sensibilidad

• No hay pérdida de muestra porque los solutos no interaccionan con la fase estacionaria

• No se desactiva la columna por la interacción del soluto con el relleno

Sin embargo, entre las desventajas encontramos:

• Sólo una cantidad limitada de bandas se pueden acomodar porque la escala de tiempo del cromatograma es corta

• Inaplicabilidad en muestras con analitos de dimensiones similares (como los isómeros). En general, se requiere una diferencia de 10 % en las masas moleculares para conseguir una resolución razonable.

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