La cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) más empleada en la actualidad es la cromatografía de reparto, en la cual la fase estacionaria es un líquido retenido sobre un soporte sólido y la separación se debe a la diferente distribución del analito entre la fase móvil y la fase estacionaria:
- Cromatografía líquido-líquido: la fase estacionaria líquida se retiene en las partículas de relleno mediante adsorción física.
- Cromatografía de fase unida químicamente: la fase estacionaria establece enlaces con la superficie del soporte.
La primera resulta problemática en la elución en gradiente y por pérdida de fase estacionaria, por lo que la cromatografía de fase unida químicamente es la más utilizada.
Los soportes empleados suelen estar formados por partículas de sílice, resistentes, porosas y con un diámetro de unos 3-5 μm. Su superficie está formada por grupos silanol químicamente reactivos:
Los recubrimientos más utilizados son los siloxanos, formados por reacción de los grupos silanol con un organoclorosilano.
Cuando la reacción se produce con un grupo alquilo de mayor tamaño, los efectos estéricos impiden que todos los grupos silanol reaccionen, afectando al resultado de la separación. Para reducir este efecto, los grupos silanol libres se desactivan haciéndolos reaccionar con clorotrimetilsilano, que debido a su pequeño tamaño puede unirse químicamente a muchos de ellos.
La polaridad de la fase estacionaria y, por lo tanto, sus propiedades para la separación dependen de la naturaleza del organoclorosilano empleado (de su grupo alquilo R).
Fase normal y fase inversa
Según sea la relación entre las polaridades relativas de las fases móvil y estacionaria distinguimos:
- Cromatografía de reparto en fase normal: la fase móvil es un disolvente apolar o poco polar (como el hexano o el isopropiléter) y la fase estacionaria presenta elevada polaridad (el grupo R es polar).
- Cromatografía de reparto en fase inversa: la fase móvil es un disolvente relativamente polar (disoluciones acuosas con etanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano) y la fase estacionaria es apolar (el grupo R es un n-octilo, C8, o n-octadecilo, C18). La longitud de la cadena del grupo alquilo influye en la eficacia de la separación, pues a mayor longitud mayores serán el tiempo de retención y el tamaño de partícula capaz de retener.
En cromatografía en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que relativamente es el más soluble en la fase móvil y un aumento de la polaridad de la misma provoca una disminución del tiempo de elución. Por el contrario, en fase inversa, los componentes más polares aparecen primero, y un aumento de la polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución.
La elección de la composición de la fase móvil no es sencilla. Debemos tener en cuenta múltiples factores:
- Orden polaridad: hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas < aldehídos < amidas < aminas < alcoholes < agua
- Habitualmente la polaridad de la fase estacionaria es distinta de la de los analitos y para la elución se emplea una fase móvil con una polaridad considerablemente distinta.
- Podemos mejorar la separación manipulando el factor de retención (k), variando la composición de la fase móvil, de manera que su valor se encuentre en el intervalo comprendido entre 2 y 10.
- También podemos recurrir si es necesario a variar el factor de selectividad (α), cambiando la naturaleza química de la fase móvil, pero manteniendo el factor de retención en los valores apropiados.
- Es útil el concepto de índice de polaridad (P’), que es una medida numérica de la polaridad de un disolvente (oscila entre –2, para los fluoroalcanos, que son muy poco polares, hasta 10’2, para el agua, muy polar). El índice de polaridad de una mezcla de disolventes A y B se calcula:
En general, se comprueba que un cambio de dos unidades de P’ origina aproximadamente una variación de 10 veces en la constante de reparto k:
Comprueba la utilidad de estas expresiones en el ejercicio 3.
Aplicaciones de la cromatografía de reparto
Son muchos los campos de aplicación que presenta la cromatografía de reparto para la separación de diferentes analitos, especialmente mediante cromatografía de fase inversa con fases unidas químicamente:
- Farmacología: antibióticos, sedantes, esteroides, analgésicos…
- Bioquímica: aminoácidos, proteínas, glúcidos, lípidos, metabolitos…
- Alimentación: edulcorantes, antioxidantes, aditivos, aflatoxinas…
- Industria química: aromáticos, condensados, tensioactivos, propulsores, colorantes…
- Contaminantes: pesticidas, herbicidas, fenoles, PCB…
- Medicina clínica y forense: venenos, drogas, alcohol en sangre, extractos de orina, estrógenos…
En algunos casos, es conveniente transformar los componentes de la muestra en un compuesto derivado, de manera que se reduzca su polaridad, se aumente la sensibilidad o la selectividad de la respuesta del detector.
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