Los detectores empleados en HPLC se han diseñado, adaptado y perfeccionado con el fin de incorporar celdas de flujo que permitan medir las bajas concentraciones de analito que hay en el líquido. Los distintos detectores se clasifican según se encarguen de medir una propiedad del soluto o de la disolución.
Detector de absorción UV-visible
El flujo de líquido que sale de la columna pasa a través de una pequeña celda, de pequeño volumen (entre 1 a 10 μL), para minimizar el ensanchamiento de banda. La medida de la absorbancia del líquido que la atraviesa en función del tiempo constituye el cromatograma. Su límite de detección oscila entre 0’1 y 1 ng y puede emplearse en cromatografía de elución en gradiente.
- Fotómetro de filtro: es el detector de absorción UV más sencillo. Emplea una lámpara de mercurio como fuente y una serie de filtros para aislar la intensa línea a 254 nm, con la que se mide la absorbancia (variando los filtros se pueden seleccionar otras líneas).
- Espectrómetro de barrido: permite realizar el análisis seleccionando una o varias longitudes de onda en la región de interés.
- Espectrómetro de arreglos de diodos: debido a su rapidez, son capaces de registrar la totalidad del espectro proporcionando un cromatograma tridimensional que muestra la absorbancia en función de la longitud de onda cada pequeños intervalos de tiempo.
DETECTOR de absorción infrarroja
Las celdas empleadas en estos detectores son similares a las empleadas en los detectores de absorción UV-vis, excepto por las ventanas ópticas, que en este caso son de cloruro de sodio o de fluoruro de calcio.
Se emplea en aquellos analitos que absorben radiación infrarroja (IR, cuya longitud de onda supera los 700 nm), por lo que se debe prestar atención al disolvente utilizado, ya que muchos de ellos también absorben estas radiaciones.
Los detectores más sofisticados se basan en instrumentos de transformada de Fourier (FTIR). El límite de detección es de 1.000 ng y también pueden emplearse en cromatografía de elución en gradiente.
DETECTOR DE Fluorescencia
Se basan en la capacidad de algunos solutos capaces de emitir fluorescencia, o de aquellos que no lo son pero pueden hacerlo tras un tratamiento adecuado (derivatización).
Los más sencillos emplean una fuente de excitación de mercurio y uno o más filtros para aislar la radiación fluorescente. Los instrumentos más sofisticados consisten en una fuente de radiación de xenón y emplean un monocromador de red para aislar la radiación fluorescente.
Son muy sensibles, siendo su límite de detección de 0’001-0’01 ng y también se pueden utilizar en elución con gradiente.
DETECTOR DE índice de refracción
En este caso miden una propiedad de la disolución, como es la variación en su índice de refracción como consecuencia de la presencia de un soluto.
Este tipo de detectores constan de una cubeta con dos compartimentos separados por una placa de vidrio, por uno de los cuales solamente pasa fase móvil, como referencia, y por el otro pasa el eluato que abandona la columna y que contiene la muestra. Sobre la cubeta se irradia un haz de luz que se desvía cuando la muestra aparece en el líquido eluido de la columna.
Son detectores universales y no dependen del caudal de fase móvil. Sin embargo, no pueden emplearse en elución con gradiente, sus medidas se ven afectadas por los cambios de temperatura y no son tan sensibles. Su límite de detección se sitúa entre 100 y 1.000 ng.
DETECTOR DE Dispersión de luz
La dispersión se produce por la interacción de la radiación electromagnética con la materia. El eluato que abandona la columna se nebuliza mediante un flujo de nitrógeno o de aire y se vaporiza la fase móvil, quedando únicamente unas finas gotitas de soluto sin evaporar. La nube de partículas de analito pasa a través de un haz de láser y la dispersión producida es detectada por un fotodiodo de silicio.
Este detector responde a todos los solutos menos volátiles que la fase móvil y su límite de detección se encuentra entre 0’1 y 1 ng.
DETECTOR electroquímico
Este tipo de detectores responden a analitos susceptibles de reducirse u oxidarse, como fenoles, aminas aromáticas, peróxidos, cetonas, aldehídos, compuestos halogenados, nitroderivados…
Un ejemplo de detector electroquímico es el detector amperométrico, basado en la oxidación o reducción del eluato en un electrodo de trabajo:
En este electrodo se mantiene el potencial a un valor seleccionado, respecto a un electrodo de referencia (Ag/AgCl) y se mide la corriente que pasa entre el electrodo de trabajo y un electrodo auxiliar, de acero inoxidable, en función del tiempo. Para solutos oxidables, son comunes los electrodos de cobre o de carbón vitrificado. Para solutos reducibles, un buen electrodo de trabajo es el de gotas de mercurio.
La corriente es proporcional a la concentración del soluto en un intervalo de seis órdenes de magnitud. Con este detector se debe trabajar en rigurosa ausencia de oxígeno y con disoluciones acuosas, o de disolventes polares, que contengan electrolitos. Presentan una gran sensibilidad, con un límite de detección entre 0’01 y 1 ng. Sin embargo, no pueden ser empleados en elución con gradiente, y dependen de la temperatura y del caudal.
DETECTOR DE conductividad
Estos detectores se basan en los cambios de conductividad de la fase móvil en presencia de moléculas de analito. Están formados por una celda asilada que contiene dos electrodos sobre los que se aplica una diferencia de potencial, de manera que se mide la resistencia que ofrece la mezcla eluida, la cual está relacionada con su concentración.
Este detector es útil para la determinación de analitos iónicos. Su límite de detección se encuentra entre 0’5 y 1 ng. es sensible a los cambios de temperatura y no puede emplearse en elución en gradiente.
DETECTOR acoplado a espectrómetro de masas
El principal problema que surge al acoplar un espectrómetro de masas al cromatógrafo HPLC es la enorme cantidad de disolvente que acompaña al analito, para lo cual se han desarrollado diversas interfases:
- Termovaporizador (termospray): con esta interfase se vaporiza el eluato y se forma un aerosol, formado por moléculas de disolvente y de analito. Mediante un mecanismo de ionización química, se ioniza el analito y los iones son conducidos hacia el espectrómetro y el disolvente es expulsado mediante una bomba. Los analitos deben ser termoestables y polares.
- Interfase de ionización química a presión atmosférica (APCI): utiliza calefacción y nitrógeno para convertir el eluato en aerosol, del que se evapora el disolvente. Mediante una descarga eléctrica el analito se convierte en iones que son conducidos hacia el espectrómetro de masas.
- Interfase de ionización por electronebulización (electrospray): el eluato pasa a través de un capilar metálico, en cuya salida se aplica un fuerte campo eléctrico a la vez que una corriente coaxial de nitrógeno gaseoso, con lo que se crea un fino aerosol de partículas cargadas.
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