Una separación cromatográfica se optimiza variando las condiciones experimentales hasta que los componentes de una mezcla se separan completamente en el menor tiempo posible.
Para ello se procurará:
- Reducir el ensanchamiento de banda: al reducir la altura de plato se aumenta la eficacia de la columna.
- Modificar las velocidades de migración (o los tiempos de retención) de los solutos: al aumentar la diferencia entre las velocidades (o los tiempos) se mejora la separación.
La resolución (Rs) de una columna es una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos (A y B), y permite evaluar la separación entre dos bandas con respecto a sus anchos:
Con una resolución igual a 1’0 el solapamiento entre los dos picos es del 4 %. Con una resolución de 1’5 el solapamiento es tan sólo del 0’3 % y permite una separación esencialmente completa de los dos componentes:
Factores que aFectan a la resolución de la columna
La resolución de la columna se puede relacionar con los factores de retención de los dos componentes A y B, el factor de selectividad y el número de platos que forman la columna:
- Variación del número de platos (N):
Se consigue mejorar la resolución de la columna aumentando el número de platos. Esto se puede conseguir aumentando la longitud (L) de la columna, lo cual aumentaría el tiempo necesario para la separación, o disminuyendo la altura de plato (H). Según la ecuación de van Deemter la altura de plato puede disminuirse con un menor diámetro de las partículas del relleno, un menor diámetro de la columna, controlando la velocidad del flujo o reduciendo la viscosidad de la fase móvil, y empleando tamaños de muestra pequeños para disminuir la resistencia a la transferencia de materia.
- Variación del factor de retención o capacidad (kB): el valor óptimo debe estar entre 1 y 5. Valores superiores no suponen un aumento significativo de la resolución, pero que dan lugar a tiempos de retención excesivos.
El factor de retención puede adecuarse modificando la temperatura, en el caso de FM gaseosas, o modificando la composición del disolvente, cuando las FM son líquidas.
- Variación del factor de selectividad (α): el aumento de α (manteniendo kB entre 1 y 5) también puede lograrse modificando la temperatura de la columna o la composición de la fase móvil, o bien, cambiando la naturaleza de la fase estacionaria o mediante algún efecto químico específico.
El problema general de la elución
En muestras complejas de un gran número de componentes, en muchas ocasiones resulta difícil encontrar unas condiciones experimentales únicas que consigan la resolución de todos los picos de los analitos y además permitan la perfecta cuantificación de los mismos.
Una solución frecuente consiste en cambiar las condiciones que afectan a k mientras tiene lugar la separación. En cromatografía de líquidos se recurre a variaciones en la composición de la fase móvil durante la elución (elución en gradiente). En cromatografía de gases, el incremento de temperatura permite conseguir las condiciones óptimas para las separaciones (programación de temperatura).
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